Встречаемость ДНК основных типов онкогенных вирусов в структуре плоскоклеточного рака и нормальной слизистой оболочки полости рта
Резюме
Актуальность. Заболеваемость злокачественными новообразованиями слизистой оболочки полости, а самое главное – смертность от данной патологии по-прежнему остаются на значительном уровне в России. В связи с этим поиск информативных прогностических и предиктивных факторов является актуальной задачей специалистов, занимающихся лечением опухолей слизистой оболочки полости рта.
Цель. Определение частоты выявления ДНК онкогенных вирусов в нормальной слизистой оболочке и очагах плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта.
Материалы и методы. Проведено проспективное исследование, в которое включены 50 здоровых добровольцев и 116 больных с впервые верифицированным плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта. Всем обследованным произведено выявление ДНК ВПГ I, II типов, ЦМВ, ЭБВ, ВПЧ-6,11типов, ВПЧ-16 и ВПЧ-18 типов с помощью ПУР в реальном времени.
Результаты. Была выявлена достоверно более редкая встречаемость ДНК ВПЧ-18 у больных плоскоклеточным раком по сравнению с нормальной слизистой оболочкой (ВПЧ-18 выявлялся в 2,8 раза реже (р < 0,0001)). В структуре плоскоклеточного рака и нормальной слизистой оболочки полости рта выявлена достоверно более частая ассоциация нормальной слизистой оболочки полости рта с ВПЧ-18, как в моноассоциации – 19 (18,0%) испытуемых в контрольной группе в сравнении с основной группой – 6 (5,2%) (р=0,008), так и в комбинацией с вирусом Эпштейна – Барр: 7 (14,0%) (контрольная группа) в сравнении с 5 (4,3%) (основная группа) (р = 0,03). Также достоверные различия получены при анализе комбинации ВПЧ-18 с цитомегаловирусом, которое было выявлено только в контрольной группе – 2 (4,0%) (p = 0,03).
Заключение. Проведенный анализ позволяет предположить, что наличие ДНК ВПЧ, тип 18, в клетках плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта может быть фактором благоприятного течения заболевания.
Заболеваемость злокачественными новообразованиями слизистой оболочки полости, а самое главное – смертность от данной патологии по-прежнему остаются на значительном уровне как в мире в целом, так и в России в частности. По данным МНИОИ им. П.А. Герцена (филиал ФГБУ «НМИц радиологии» Минздрава России), ежегодная смертность от данной патологии (по данным 2017 года) приближается к 50% от всех впервые выявленных случаев заболевания. Морфологическое формирование очага плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта является сложным многоступенчатым процессом, и основополагающими этиологическими факторами его развития являются табакокурение, злоупотребление алкоголем и неадекватная гигиена полости рта, которые пагубно влияют на структуру нормальной слизистой оболочки, особенно у лиц, имеющих генетическую предрасположенность к развитию онкопатологии. Кроме общеизвестных факторов риска возникновения плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта и зарегистрированных предопухолевых заболеваний, имеется целый ряд факторов, таких как вирусные инфекции и воспаление, которые возможно могут являться важным звеном в патогенезе злокачественных заболеваний и могут потенцировать развитие 15-20% злокачественных новообразований.
Цель исследования
Определение частоты выявления ДНК вирусов простого герпеса I и II типов (ВПГ-I,II), цитомегаловируса (цМВ), вируса Эпштейна – Барр (ЭБВ) и вирусов папилломы че-ловека 6,11, 16 и 18 типов (ВПч-6,11, ВПч-16, ВПч-18) в нормальной слизистой оболочке полости рта и очагах плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта.
Материалы и методы исследования
Для достижения поставленной цели проведено проспективное исследование, в которое были включены 50 здоровых добровольцев (контрольная группа), находившихся на диспансерном наблюдении клинике челюстно-лицевой и пластической хирургии ГБОУ ВПО сПбГМУ им. акад. И.П. Павлова в период с 2012 по 2013 гг. и 116 больных (основная группа), которым был впервые верифицирован диагноз «плоскоклеточный рак слизистой оболочки полости рта» в сПб ГБУЗ «Городской клинических онкологический диспансер» в период с 2012 по 2013 гг. Общий период наблюдения продолжался до 17.07.2019 г., после чего был произведен окончательный анализ данных.
Основные критерии включения больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта в исследование:
Подписание формы добровольного информированного согласия для участия в исследовании.
Возраст, старше 18 лет.
Морфологическая верификация диагноза «плоскоклеточный рак слизистой оболочки полости рта».
Основные критерии невключения больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта в исследование:
Выявленные отдаленные метастазы плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта.
Основные критерии включения в группу здоровых добровольцев:
Подписание формы добровольного информированного согласия для участия в исследовании.
Возраст, старше 18 лет.
Отсутствие зарегистрированных на момент включения в исследование заболеваний слизистой оболочки полости рта воспалительного, опухолевого или другого характера.
Основные критерии невключения в группу здоровых добровольцев:
Гистологическая верификация диагноза «плоскоклеточный рак слизистой оболочки полости рта».
Общая характеристика больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта.
В основной группе было 77 мужчин (66,38 %) и 39 женщин (33,62 %). средний возраст пациентов составил 60,80 ± 0,96 лет (95% ДИ 58,90-62,70).
У 49 (42,24%) больных первичный опухолевый очаг локализовался в области передней и средней третей языка, у 32 (27,60%) была слизистая оболочка дна полости рта. слизистая оболочка альвеолярной части нижней челюсти была поражена у 8 (6,90%) больных, щека – у 7 (6,03%) больных. Реже поражались передняя небная дужка и слизистая оболочка крылочелюстной складки – у 3 (2,59%) больных, альвеолярный отросток верхней челюсти, ретромолярная область и твердое небо – у 2 (1,72%) больных, а мягкое небо и нижняя губа – у 1 (0,86%) больного соответственно.
Ранние стадии болезни (0, I и II) были диагностированы у 24 (20,69%) больных (1,72%, 5,17% и 13,80% соответственно). У 18 (15,52%) больных была выявлена III стадия заболевания, а более половины больных – 68 (58,62%) первично обратились уже с IVА стадией. У 6 (5,17%) больных первичная опухоль была признана неоперабельной (T4b) или поражение регионарных лимфатических узлов превышало 6 см (N3) – IVB стадия.
Проведенное гистологческое исследование выявило, что у 35 (30,17%) дифференцировка опухоли была высокой (G1), у 34 (29,31%) – умеренная (GII), а у 13 (11,21%) больных степень дифференцировки опухоли была низкой (GIII). В трети случаев – 34 (29,31%) – степень дифференцировки не была определена.
В 51 (43,97%) случае были выявлены гистологические признаки ороговения, в 29 (25,00%) случаев опухоль не имела признаков ороговения, в 5 (4,31%) степень ороговения была определена как частичная, а в 31 (26,72%) образце наличие ороговения не оценено.
Общая характеристика здоровых добровольцев.
Группу здоровых добровольцев составили 30 (60,0%) мужчин и 20 (40,0%) женщин. средний возраст составил 55,7 лет (95% ДИ 47,60-61,35).
34 (68,0%) респондента обратились за консультацией по поводу дентальной имплантации, 12 (24,0%) респондентам показана хирургическая подготовка к ортодонтическому лечению и 4 (8,0%) респондента были консультированы по поводу ретенции/дистопии зубов. сформированные группы были сопоставимы по демографическим показателям – полу и возрасту.
Методика выявления днк вирусов с помощью полимеразной цепной реакции (Пцр) в реальном времени.
Забор материала проводили под местной инфильтрационной анестезией из первичной опухоли больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта и десны верхней или нижней челюсти здоровых добровольцев; размер образца составлял 0,5 х 0,5 см. После забора, образец фиксировали растворе этилен-диаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и замораживали при температуре –25 °с.
Выявление вирусной ДНК осуществляли с помощью полимеразная цепная реакция в реальном времени (Лаборатория молекулярной диагностики ГБОУ ВО ПсПбГМУ им. И.П. Павлова). Для качественного выявления ДНК использовали специализированные диагностические наборы, согласно инструкциям фирм-производителей. чувствительность ПцР-методов стандартно составляла 102 генокопий в одной пробе.
Методика статистического анализа.
Переменные, отражающие признаки, анализировались с помощью описательной статистики. с целью определения используемых описательных категорий количественных переменных они были оценены на нормальность распределения с применением теста Шапиро – Уилка. Во всех случаях полученные данные подчинялись нормальному распределения, в связи с чем их описание производилось с помощью среднего выборочного и ошибки среднего (M ± m). сравнение групп испытуемых по частоте встречаемости признака проводили с использованием z-критерия (с поправкой Йетса на непрерывность). Все показатели рассчитывалась с двусторонним 95% доверительным интервалом (ДИ) и значением двустороннего «р». статистическая обработка производилась с помощью пакета прикладных программ Statistica® (StatSoft, ver. 12.0) и MedCalc® (ver. 19.0.7).
Результаты анализа частоты выявления ДНК вирусов с помощью ПЦР в реальном времени
Проведенный анализ позволил установить, что частота отсутствия ДНК вирусов в обеих группах была одинаковой, у 54 (46,6%) больных основной группы в структуре опухоли вирусной ДНК выявлено не было, а в контрольной группе вирусная ДНК отсутствует у 17 (34,0%) обследованных (р = 0,13). У остальной когорты обследованных достоверно чаще регистрировалась ДНК вируса Эпштейна – Барр (ЭБВ) – у 40 (34,48%) больных основной группы (р < 0,0001) и 15 (30,00%) здоровых добровольцев (р = 0,03). Плоскоклеточный рак слизистой оболочки полости рта был достоверно чаще ассоциирован с ДНК вирусов папилломы человека как в общем в 48 (41,4%) случаях (p < 0,0001), так и по рассматриваемым подтипам: ВПч-6,11 – 16 (13,8%) (p = 0,005), ВПч-16 – 12 (10,3%) (p = 0,001), ВПч-18 – 20 (17,2%) (р < 0,0001). В контрольной группе ДНК ВПч выявлялась достоверно чаще только в общем – 27 (54,0%) (р < 0,0001), и в ВПч-18 – 24 (48,0%) (р < 0,0001).
Проведенный сравнительный анализ частоты регистрации вирусный ДНК в обеих группах позволил выявить следующие результаты, представленные в таблице 1.
В ходе нашего исследования была выявлена достоверно более частая встречаемость ДНК ВПч-18 в клетках слизистой оболочки полости рта здоровых добровольцев по сравнению с больными плоскоклеточным раком – в контрольной группе ВПч-18 выявлялся в 2,8 раз чаще (р < 0,0001).
Однако следует понимать, что ДНК только одного типа вирусов в основной группе была выявлена лишь у трети больных – 34 (29,3%), а в контрольной – у 19 (38,0%) обследованных (р = 0,14). Два типа вирусной ДНК также одинаково часто регистрировались как в основной – 24 (20,7%), так и в контрольной – 14 (28,0%) группах (р = 0,16). Ассоциация трех или четырех типов вирусных ДНК выявились только у больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта – 3 (2,6%) и 1 (0,9%) (р = 0,26) (табл. 2).
Результаты поданализа комбинаций вирусов в структуре плоскоклеточного рака и нормальной слизистой оболочки полости рта выявили достоверно более частую ассоциацию нормальной слизистой оболочки полости рта с ВПч-18, как в моноассоциации – 19 (18,0%) испытуемых в контрольной группе в сравнении с основной группой – 6 (5,2%) (р = 0,008), так и в комбинацией с вирусом Эпштейна – Барр: 7 (14,0%) (контрольная группа) в сравнении с 5 (4,3%) (основная группа), (р = 0,03). Также достоверные различия получены при анализе комбинации ВПч-18 с цитомегаловирусом, которое было выявлено только в контрольной группе – 2 (4,0%) (p = 0,03). с другой стороны, сочетание ЭБВ с ВПч-16 было зарегистрировано только у 6 (5,2%) больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта с тенденцией к более частой встречаемости подобной комбинации (р = 0,1).
Обсуждение
Проведенный нами анализ позволил достоверно показать, что отсутствие ассоциации слизистой оболочки полости рта одинаково часто встречается как в неизменной слизистой оболочке, так и в очагах плоскоклеточного рака, что позволяет говорить о сопоставимости рассматриваемых пациентов.
В ходе исследования нами была зарегистрирована более частая выявляемость ДНК вируса папилломы человека 18 типа в структуре нормальной слизистой оболочки полости рта, как в моноассоциации, так и в комбинации ВПч-18 с другими типами вирусов (ЭБВ, цМВ). Подобные исследования и схожие результаты, в основном в отношении ВПч-18, были получены, например, еще Yeudall W. A. и Campo M. S. (Великобритания) в 1991 году: с помощью ПцР проанализировали 25 образцах нормальной слизистой оболочки полости рта, в 8% которых удалось выявить ДНК ВПч-18, когда в структуре плоскоклеточного рака ДНК ВПч-18 выявлялалсь в 20,5% случаев из 39 обследованных. Однако данные литературы неоднозначны: например, Saghravanian
N. с соавторами (Иран) в 2011 году проанализировали 18 образцов нормальной слизистой оболочки и 21 образец плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта и выявили, что в неизмененной слизистой ДНК ВПч-16 и ВПч-18 не выявилась ни в одном образце, а в очагах плоскоклеточного рака были 3 (14,3%) положительных анализа на эти типы вирусов. В 2017 году Liu T. с соавторами (Китай) с помощью иммуногистохимического анализа проанализировали частоту ассоциации 22 образцов нормальной слизистой оболочки полости рта и в 6 образцах плоскоклеточного рака с ВПч 16 и 18 типов, где ДНК вирусов была выявлен в 62,5% случаев группы здоровых добровольцев и у всех 6 (100%) пациентов с онкопатологией. Результаты нашего исследования достоверно показывают, что плоскоклеточный рак слизистой оболочки полости рта чаще ассоциирован с ДНК вирусов папилломы человека как в общем в 41,4% (48) случаев, так и по отдельным вирусным подтипам: ВПч-6,11 – 13,8%, ВПч-16 – 10,3%, ВПч-18 – 17,2%, тогда как в нормальной слизистой оболочке ДНК ВПч выявлялась достоверно чаще только в совокупности – 54,0% и в случае ВПч-18 типа – 48,0%, в сравнении с стальными подтипами, которые встречались значительно реже.
Российских исследований, посвященных рассматриваемому вопросу, крайне мало, возможно сказать, что они единичные, и количество обследованных в них исследованиях малочисленны. Одним из последних исследований является работа Кирьянова с. А. с соавторами, представленное в конце 2019 года: авторы обследовали 10 пациентов с плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта на наличие ДНК ВПч и ЭБВ с помощью реакции ПцР в реальном времени, и выявили, что ДНК ВПч не встречалась ни в одном образце опухолевой ткани, а вот ДНК ЭБВ была выявлена в 7 (70,0%) случаях. В нашем исследовании ДНК вируса Эпштейна – Барр (ЭБВ) была выявлена только у 34,48% (40) больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта и у 30,00% (15) здоровых добровольцев.
Анализ полученных данных позволяет предположить, что выявление ДНК ВПч 18 типа в клетках плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта может быть фактором благоприятного течения заболевания, а показатели выживаемости и эффективность противоопухолевого лечения у данной когорты пациентов будет превалировать над аналогичными показателями ВПч-18-негативных больных. Таким образом, проведение нашего исследования на значительном клиническом материале, возможно, по-новому позволит посмотреть на вирусы как достоверный этиологический фактор развития плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта. Особое внимание, по нашему мнению, следует уделить ассоциации плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта с ВПч-18, как вероятного этиологического фактора развития злокачественного перерождения структур слизистой оболочки полости рта. Однако, без сомнения, требуется дальнейшее глубокое изучение данного вопроса, с целью определения действительной роли вирусного фактора в развитии и течения плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта.
Кутукова С.И., Чухловин А.Б., Яременко А.И., Иваськова Ю.В., Разумова А.Я., Ермакова Т.С.
Список литературы
Состояние онкологической помощи населению России в 2018 году. Под ред. А. Д. Каприна, В. В. старинского, Г. В. Петровой. Москва: МНИОИ им. П.А. Герцена – филиал ФГБУ «НМИц радиологии» Минздрава России, 2019. илл. 236. ISBN 978-5-85502-250-6. [The status of cancer care for the population of Russia in 2018. Ed. A. D. Kaprina, V. V. Starinsky, G. V. Petrova. Moscow: MNII them. P.A. Herzen – a branch of the Federal State Budgetary Institution Scientific Research Center for Radiology of the Russian Ministry of Health, 2019. ill. 236. ISBN 978-5-85502-250-6. (In Russ.)].
Y. K. Chen, H. C. Huang, L. M. Lin, C. C. Lin. Primary oral squamous cell carcinoma: an analysis of 703 cases in southern Taiwan. Oral Oncol. 1999;35:173-179. https://doi.org/10.1016/s1368-8375(98)00101-8.
P. A. Reichart. Identification of risk groups for oral precancer and cancer and preventive measures. Clin Oral Investig. 2001;5:207-213. https://doi. org/10.1007/s00784-001-0132-5.
J. H. Meurman. Infectious and dietary risk factors of oral cancer. // Oral Oncol. 2010;46:411-413. https://doi.org/10.1016/j.oraloncology.2010.03.003.
W. A. Yeudall, M. S. Campo. Human papillomavirus DNA in biopsies of oral tissues. Journal of General Virilogy. 1991;72:173-176. https://doi. org/10.1099/0022-1317-72-1-173.
N. Saghravanian, K. Ghazvini, S. Babakoohiet et al. Low prevalence of high risk genotypes of human papilloma virus in normal oral mucosa, oral leukoplakia and verrucous carcinoma. Acta Odontologica Scandinavica. 2011;69:406-409. https://doi.org/10.3109/00016357.2011.572560.
T. Liu, H. Zhang, X. Yang et al. Study on expression of p16 and human papillomavirus’16 and 18 (E6) in OLP and its malignant transforma-tion. Pathology – Research and Practice. 2018;214(2):296-302. https://doi. org/10.1016/j.prp.2017.09.014.
Кирьянов с. А., Левина Т. А., Поляков А. П., Ребрикова И. В., Мурашко Д. А., Коноплева М. В., семененко Т. А., суслов А. П. Выявление геномной ДНК вируса Эпштейна-Барр в тканях рака слизистой оболочки полости рта российских пациентов. Вопросы вирусологии. 2019;64(3):112-117. https://doi. org/10.18821/0507-4088-2019-64-3-112-117. [S. A. Kiryanov, T. A. Levina, A. P. Polyakov, I. V. Rebrikova, D. A. Murashko, M. V. Konopleva, T. A. Semenenko, A. P. Suslov. Detection of Epstein-Barr virus genome in oral cavity squamous cell carcinoma samples of Russian patient. Problems of Virology, Russian journal. 2019;64(3):112-117. (In Russ.)]. https://doi.org/10.18821/0507-4088-2019-64-3-112-117.