Контрастная микро-КТ для оценки дебридирования пульпы в корневых каналах удалённых зубов: серия каскадных экспериментов для валидации метода

Аннотация

Цель: Проверить новый метод оценки удаления пульповой ткани в корневых каналах удаленных зубов с использованием протокола импрегнации, включающего трийодид калия, радиоконтрастный раствор, известный как раствор Люголя, в сочетании с микрокомпьютерной томографией (микро-КТ).

Методология: Влияние NaOCl на радиопрозрачность раствора Люголя оценивалось с использованием двухкратной серии разбавлений раствора Люголя в дистиллированной воде и 5,25% NaOCl, которые затем были отобраны в прозрачные чаши и рентгенографированы. Чтобы проверить влияние Люголя на протеолитический эффект NaOCl, был проведен тест на растворение с использованием свежего говяжьего мяса. Десять срезов не подвергались никакой обработке ткани, в то время как двадцать срезов были зафиксированы в формальдегиде на 24 часа. После этого 10 из них были погружены в раствор Люголя еще на 24 часа. Затем все образцы были помещены в NaOCl, и время, необходимое для полного растворения ткани, было зафиксировано. Для последних экспериментов (гистологическая валидация и оценка микро-КТ) 8 удаленных нижних премоляров с ранее жизнеспособными пульпами были погружены в буферный формалин, отсканированы в устройстве микро-КТ, оценены, погружены в раствор Люголя на 7 дней и снова отсканированы. Затем корневые каналы 5 зубов были подготовлены и отсканированы, а объем оставшейся пульповой ткани был идентифицирован и количественно оценен, в то время как 3 зуба были обработаны гистологически. Те же образцы были подвергнуты гистологической оценке, и изображения гистологических срезов были зарегистрированы с соответствующими изображениями микро-КТ, чтобы проверить, совпадает ли пульповая ткань в гистологических срезах с ее аналогом в тканях, импрегнированных раствором Люголя, идентифицированных в срезах микро-КТ.

Результаты: Не было заметного эффекта на радиопрозрачность, когда NaOCl смешивался с раствором Люголя. Обработка тканей не повлияла на время, необходимое для полного растворения свежего говяжьего мяса. Гистологическая оценка выявила корреляцию между микрокомпьютерной томографией (микро-КТ) и гистологическими изображениями, подтверждающими идентификацию пропитанной Люголем пульпы на изображениях микро-КТ. Заключения: радиоконтрастный раствор Люголя не подвергся влиянию NaOCl и не мешал его способности растворять мягкие ткани. Протокол имплантации с использованием раствора Люголя позволил визуализировать пульповые ткани на изображениях микро-КТ и идентифицировать остатки пульпы после химико-механических процедур обработки каналов.

Введение

Обычный анализ гистологических срезов и использование рентгеновской микро-компьютерной томографии (микро-КТ) считаются золотым стандартом для оценки процедур очистки и формовки во время подготовки корневых каналов. Хотя микро-КТ позволяет идентифицировать и количественно оценивать минерализованные ткани корневого канала, удаленные механической подготовкой, количество оставшейся (неминерализованной) пульпы обычно оценивается на гистологических срезах. Таким образом, несмотря на полезность технологии микро-КТ, этот метод был ограничен оценкой изменений вдоль стенок канала, включая транспортировку и создание аномалий, таких как зипы и перфорации. Из-за проникающей способности рентгеновских лучей методы микро-КТ предоставляют 3D-карту плотности образцов и тканей, которые сильно поглощают это излучение (Alfaro и др. 2015, Cunha и др. 2015). Однако он не подходит для визуализации мягких тканей, таких как зубная пульпа, поскольку эти ткани поглощают рентгеновские лучи в очень ограниченной степени (Gignac & Kley 2014).

Недавно в двух исследованиях был использован корреляционный подход с использованием гистологии в качестве дополнительного метода для оценки микро-КТ для оценки различных химико-механических протоколов в корневых каналах (Lacerda и др. 2017, Siqueira и др. 2018). Оба исследования продемонстрировали гистологически наличие остатков пульповой ткани, прикрепленных к нетронутым стенкам канала, ранее идентифицированным с помощью анализа микро-КТ. Хотя этот корреляционный подход с использованием различных методов может позволить установить механизмы причинности, гистологический анализ обычно позволяет оценить только несколько срезов на корень, что предоставляет очень ограниченные данные и не соответствует объему информации в сотнях поперечных изображений, которые обычно производятся при сканировании микро-КТ типичного корневого канала. Более того, гистологическое секционирование является трудоемкой и дорогостоящей процедурой, которая разрушает образец.

Очевидно, что желательно разработать надежный недеструктивный экспериментальный метод, способный одновременно оценивать качество и количество мягких и твердых тканей в гетерогенном образце, таком как человеческий зуб. В других областях исследований это ограничение было преодолено с использованием различных контрастных агентов, таких как осмий, золото, сульфат бария и красители на основе йода (Metscher 2009a, b, Faulwetter и др. 2013, Pauwels и др. 2013). В целом было продемонстрировано, что водный раствор йода Люголя, также называемый йод–калий йодидом (I₂KI), является одним из самых эффективных средств для быстрого различия различных типов мягких тканей. Раствор Люголя является простым, экономически эффективным, нетоксичным и быстрым вариантом окрашивания для улучшения контраста мягких тканей. Тем не менее, его использование было ограничено анатомическими исследованиями широкого спектра биологических образцов с использованием широкого диапазона различных концентраций йода и продолжительности окрашивания, в зависимости от типа ткани (Heimel и др. 2019). В настоящее время, несмотря на то, что импрегнация Люголем является наиболее широко используемым контрастным агентом в анатомическом исследовании мягких тканей, до сих пор неясно, будет ли этот раствор подходящим для оценки микро-КТ пульповой ткани после дебридмента корневого канала ex vivo. Одним из основных вопросов при использовании Люголя является гипохлорит натрия (NaOCl), основной эндодонтический ирригант, используемый для растворения некротической пульповой ткани (Zehnder 2006), который реагирует с йодом (Vogel 1978) и, таким образом, может вмешиваться в его импрегнацию и видимость на рентгенографических изображениях.

Настоящее сообщение сообщает о серии каскадных экспериментов, направленных на введение и исследование потенциала визуализации зубной пульпы на микрокомпьютерных томограммах с использованием Люголя в качестве контрастирующего раствора. Каскад экспериментов был направлен на валидацию протокола имплантации и метода контрастной микрокомпьютерной томографии (КТ с контрастом), а также на выявление преимуществ и потенциальных ограничений этой новой методологии. Каскадные эксперименты были разработаны для:

• Оценки потенциала NaOCl для снижения степени радиографического контраста, связанного с Люголем (тест радиопрозрачности);
• Проверки возможности влияния раствора Люголя на протеолитический эффект NaOCl (тест растворения мягких тканей);
• Оценки способности раствора Люголя правильно имплантировать пульпную ткань с помощью корреляционной визуализации Люголя, улучшенной микрокомпьютерной томографии и традиционной гистологии (гистологическая валидация);
• Измерения оставшегося объема пульпной ткани, пропитанной Люголем (объемная оценка микрокомпьютерной томографии).

Материалы и методы

Влияние NaOCl на радиопрозрачность раствора Люголя

Раствор Люголя (I₂KI), использованный для всех экспериментов, имел концентрацию 5% I₂ и 10% KI. Для оценки влияния NaOCl на его радиопрозрачность была выполнена серия разбавлений 1:1 в дистиллированной воде и 5.25% NaOCl (всего 1.5 мл). Чистый раствор и его разбавления были отмерены в круглые прозрачные полистироловые чаши (Semadeni, Остермундиген, Швейцария) с внутренним диаметром 23.4 мм и глубиной 3.5 мм. Радиопрозрачность определялась с использованием стандартной установки, как описано ранее (Hertig и др. 2017). Кратко, электронные наборы данных были сгенерированы с использованием фиксированного устройства (Trophy, Париж, Франция) при 65 кВ, 8 мА и 0.22 с с расстоянием фокус-пленка 25 см и электронными датчиками (Digora; Soredex, Туусула, Финляндия). Изображения анализировались с использованием ImageJ (Бетесда, Мэриленд, США). Серые значения были нормализованы в каждом изображении относительно алюминиевой ступенчатой призмы, с индивидуальной стандартной кривой для каждого изображения. Эксперименты проводились в тройных образцах. Относительная радиопрозрачность раствора Люголя и его разбавлений выражается как алюминиевый эквивалент (в мм) на мм раствора.

Тест на растворение мягких тканей

Тридцать кусочков свежего говядины были приведены к аналогичному весу (2 мг) и размерам (4 x 4 мм) с использованием хирургического лезвия № 15. Десять кусочков не подвергались никакой обработке тканей, в то время как остальные 20 были зафиксированы в формальдегиде на 24 часа. После этого 10 зафиксированных кусочков были дополнительно погружены в раствор Люголя на еще 24 часа. Затем все образцы были помещены по отдельности в колбы, содержащие 40 мл 5,25% NaOCl, и общее время, необходимое для полного растворения пульповой ткани (в минутах), было зафиксировано. Все испытательные процедуры проводились при комнатной температуре. Это исследование не классифицировалось как исследование на животных, поскольку оно не оказало влияния на предсмертную судьбу или процесс убоя животных. Предварительный анализ сырых данных показал соблюдение гауссовского распределения (тест Шапиро–Уилка, P < 0.05). Данные сравнивались между группами с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), за которым следовал тест Тьюки HSD. Альфа-ошибка была установлена на уровне 5%.

Оценка остатков пульповой ткани с помощью микро-КТ

После одобрения местным этическим комитетом (протокол № 12127319.3.0000.5243) восемь некариозных однокорневых нижних премоляров и один нижний моляр с жизнеспособными пульпами, удаленные по ортодонтическим показаниям, были погружены в 10% буферный формалин и хранились до 30 дней при 15 °C. Затем зубы были отсканированы с размером пикселя 14.37 мкм с использованием устройства микро-КТ (SkyScan 1173; Bruker microCT, Контрих, Бельгия), настроенного на 70 кВ, 114 мА, 360° вращения вокруг вертикальной оси с шагом вращения 0.5°, среднее значение кадров 5, с использованием алюминиевого фильтра толщиной 1.0 мм. Программное обеспечение NRecon v.1.7.16 (Bruker micro-CT) использовалось для реконструкции проекций микро-КТ в аксиальные срезы с использованием коррекции кольцевых артефактов 4, пределов контраста от 0.006 до 0.05 и коррекции жесткости пучка 40%, что привело к получению 800–900 изображений в градациях серого на зуб от соединения цемента и эмали до верхушки. Для проверки морфологии канала поперечные изображения были сегментированы с использованием автоматической процедуры (De-Deus и др. 2020) в программном обеспечении FIJI/ImageJ (Fiji v.1.51n; Мадисон, ВИ, США), и соотношение сторон корневого канала, определяемое как отношение больших и малых диаметров, измерялось в каждом срезе от отверстия до апикального отверстия. Затем объем канала (в мм³) рассчитывался как объем бинаризованного корневого канала в пределах интересующего объема.

После подготовки обычной доступа к полости, каждый зуб был погружен в раствор Люголя на 7 дней и подвергнут новому сканированию и процедурам реконструкции с использованием ранее упомянутых параметров для оценки пропитывания всей пульпы контрастным раствором. Этот набор изображений был совмещен с неокрашенным набором данных с использованием аффинного алгоритма, реализованного в программном обеспечении 3D Slicer 4.6.0 (http://www.slicer.org) (Федоров и др. 2012), и корневая дентинная часть зуба после погружения была удалена с помощью булевой операции для уменьшения шума, создаваемого сегментацией пульпы. Таким образом, пульпа, пропитанная раствором Люголя, была наблюдаема и количественно оценена (в мм³) с помощью процесса сегментации с использованием специфического порогового значения, с использованием инструмента Object Counter, доступного в программном обеспечении FIJI/ ImageJ. После этого корневые каналы 5 из 8 выбранных премоляров были химико-механически подготовлены, в то время как остальные 4 здоровых зуба (3 премоляра и 1 моляр) были подготовлены для гистологического сечения, чтобы подтвердить наличие остатков пульпы (контрольная группа).

Подготовка корневого канала

Корневые каналы были подготовлены до рабочей длины с помощью инструмента Reciproc R25 (VDW GmbH, Мюнхен, Германия), приводимого в действие мотором VDW Silver (VDW GmbH) в программе предустановки «RECIPROC ALL», с легким апикальным давлением и медленным движением с амплитудой 3 мм. После завершения трех движений инструмент был удален из канала, а его канавки очищены путем вставки в губку, смоченную алкоголем. Рабочая длина была достигнута после 3 волн инструментирования. Апикальная проходимость была выполнена с помощью K-файла размера 15 (Dentsply Sirona Endodontics, Баллаиг, Швейцария) на протяжении всех процедур подготовки. Ирригация проводилась с общим объемом 12 мл 5.25% NaOCl, введенного в корневой канал с помощью иглы 31-G NaviTip с двойным боковым портом (Ultradent Inc., Южный Джордан, ЮТА, США), введенной на 1 мм короче рабочей длины на протяжении всех процедур подготовки. После подготовки корневого канала образцы были повторно отсканированы, реконструированы и сопоставлены с использованием вышеупомянутых параметров. Затем объем остатков пульповой ткани, пропитанных раствором Люголя, был рассчитан (в мм³) и количественно оценен в процентном соотношении на основе начального объема пульповой ткани.

Гистологическая оценка

После экспериментальных процедур, описанных выше, образцы деминерализовали в 22,5% (об/об) формальдегидной кислоте плюс 10% (масс/об) растворе натриевого цитрата в течение 2–3 недель. Конечная точка контролировалась радиографически. Затем образцы промывали в течение 24 часов в водопроводной воде, дегидратировали и обрабатывали для рутинного гистологического исследования. Зубы встраивались в парафиновые блоки, и получали серийные поперечные срезы толщиной 0,6 мкм каждые 1 мм от цементно-эмалевого соединения до верхушки, в результате чего получалось 8 срезов на зуб. Полученные срезы монтировались на стеклянные пластины и окрашивались гематоксилин-эозином. Гистологические изображения визуализировались с использованием полностью моторизованного светового микроскопа Axioplan 2 Imaging (Carl Zeiss Vision, Hallbergmoos, Германия).

Сопоставление микрокомпьютерной томографии с йодистым раствором и гистологическими срезами

Полученные срезы микрокомпьютерной томографии, содержащие йодистую пропитку пульповой ткани, были исследованы вдоль оси z с использованием системы координат на основе алгоритма регистрации, основанного на ориентире (программное обеспечение Analyze; Biomedical Imaging Resource, Mayo Clinic, Rochester, MN, США), чтобы выровнять их с микрорентгенографическими изображениями гистологических срезов. После выбора соответствующих изображений была выполнена корректировка размерности, включая автоматическое увеличение, изменение размера и обрезку, с помощью компьютерной процедуры. Этот процедурный шаг позволил экзаменаторам надежно исследовать корни на одних и тех же уровнях и, таким образом, качественно проверить, соответствует ли пульповая ткань в гистологическом срезе своей аналогии в срезе микрокомпьютерной томографии с йодистым раствором, подтверждая эффективность протокола пропитки и параметров сканирования. Два предварительно откалиброванных экзаменатора использовали формуляр с заранее определенными критериями для анализа степени соответствия между изображениями с йодистым раствором и гистологическими изображениями. Процедура анализа изображений проводилась на 34-дюймовом высококачественном компьютерном мониторе с возможностью увеличения изображений (до 10x) и изменения цветового режима. Для валидации аналитического процесса анализы повторялись дважды с интервалом в 10 дней для оценки воспроизводимости.

Результаты

Влияние NaOCl на радиопрозрачность раствора Люголя

Чистый раствор Люголя имел радиопрозрачность 0.70 ± 0.09 мм Al мм^-1. Разбавление в 5.25% NaOCl оказало аналогичное влияние на радиопрозрачность, как и контрольная процедура в воде, при этом более высокие разбавления в NaOCl показали немного более высокую радиопрозрачность (Рис. 1), что основано на разнице в радиопрозрачности между чистым раствором 5.25% NaOCl и водой в 0.05 мм Al мм^-1. Не было заметного влияния на радиопрозрачность, вызванного химическим взаимодействием между NaOCl и раствором Люголя, что было видно по обесцвечиванию коричневого цвета в присутствии NaOCl.

Тест на растворение мягких тканей

Виолончельные графики иллюстрируют средние, минимальные и максимальные значения, а также распределение данных о растворении тканей среди образцов (Рис. 2). Обработка тканей формальдегидом и раствором Люголя не повлияла на время, необходимое для растворения свежего говядины (P > 0.05).

Гистологическая валидация

Общее качество используемого протокола окрашивания иллюстрируется на рисунке 3. Корреляционный анализ между микрокомпьютерной томографией и гистологическими изображениями подтвердил идентичность ткани пульпы, пропитанной Люголем, на изображениях микрокомпьютерной томографии. Результаты сопоставленных изображений микрокомпьютерной томографии и гистологии показаны на рисунках 4 и 5, подтверждая качество протокола окрашивания.

Оценка объемного микро-КТ

Кроме того, сегментированные остатки пульпы после подготовки корневого канала были количественно оценены и выражены в процентном соотношении. Объем инструментированного корневого канала и неинструментированных участков канала, полученные методом микро-КТ, также были количественно оценены (Таблица 1) и проиллюстрированы на рисунках 6 и 7 и в дополнительном видео 1. Объем корневого канала и соотношение сторон непосредственно влияли на удаление пульповой ткани во время инструментирования. Зубы с соотношением сторон менее 3,5, выраженные графической кривой и высокими объемами, были связаны с меньшими объемами остатков пульповой ткани.

Обсуждение

Данное сообщение представляет собой новый метод окрашивания тканей зубной пульпы в контексте микрокомпьютерной томографии (микро-КТ) для оценки очистки корневых каналов, что имеет очевидные полезные применения для будущих исследований в этой области. Предложенный неразрушающий метод способен предоставлять изображения высокого разрешения и 3D-информацию о ткани пульпы и дентине одновременно, что позволяет проводить продольную и количественную объемную оценку процедур очистки и формовки корневых каналов. С тех пор как Гиси и Розе (1894) опубликовали первые качественные фотомикрографии, изображающие детали сосудистых, лимфатических и нервных элементов комплекса пульпы и дентин, а Кёлликер (1852) предоставил первое описание зубной пульпы, названной им Pulpa dentis, в своей классической книге о мельчайших структурах тканей и органов тела, многие исследования изучали зубы с использованием гистологических методов. Используя эту технику, Хаттон и др. (1928) первыми продемонстрировали, что канал был очищен только поверхностно, и большая часть ткани пульпы не была удалена после подготовки нержавеющими инструментами. Однако только после того, как Уолтон (1976) опубликовал основополагающее исследование, оценивающее количество оставшейся ткани пульпы после процедур очистки и формовки, гистологическая секционирование на основе парафина стало стандартным методом для определения эффективности процедур очистки в пространстве корневого канала.

В неповрежденных зубах с жизнеспособными пульпами, которые обычно используются в качестве контроля в исследованиях гистологического среза, пульповая ткань прикреплена ко всему периметру корневого канала (De-Deus и др. 2010, 2011), в то время как остатки ткани в экспериментальных группах подтверждают, какие участки вдоль стенок канала не были механически очищены или где протоколы ирригации оказались неэффективными. Поскольку остатки пульпы могут служить субстратом для бактерий и могут негативно влиять на качество процедур заполнения канала (Ricucci и др. 2009, Ricucci & Siqueira 2011), это теоретически поддерживает эту экспериментальную переменную, оставшуюся пульповую ткань, как принятый суррогатный конечный показатель качества процедур дебридмента в пространстве корневого канала. Однако процессы и результирующая нагрузка по подготовке образцов, которые включают секционирование, окрашивание, визуализацию и окончательную комплексную гистологическую оценку, остаются громоздкой и трудоемкой техникой. В частности, в контексте эндодонтических лабораторных исследований, декальцинация минерализованных зубных тканей является времязатратным и сложным этапом, и сложно получить образцы высокого качества без повреждения пульповой ткани. Это становится еще более важным, поскольку, в общем, гистологическое секционирование декальцинированных твердых тканей склонно вызывать значительные искажения тканей, сбои в обработке и структурные артефакты. Например, усадка ткани до 3% происходит с костными тканями (Lane & Ráliš 1983, Henson и др. 1994), в то время как обезвоживание мягкой ткани может создать усадку до 11% (Rown и др. 2002). Таким образом, даже с полезными данными, доступными в литературе по этой теме, стоит отметить, что количественные данные микроскопии из гистологического секционирования были получены из тканей, которые предположительно усохли во время подготовки образцов. Более того, техники гистологического секционирования неизбежно приводят к потере образцов, что делает невозможными продольные эксперименты с течением времени. Следовательно, гистология может считаться архаичным методом по сравнению с объемным и количественным подходом, достигнутым с помощью неразрушающих методов визуализации (Таблица 2), хотя на сегодняшний день это остается единственной доступной экспериментальной моделью, которая позволяет одновременно оценивать как минерализованные твердые, так и мягкие ткани зубов на их ультраструктурном уровне и, соответственно, может пролить свет на эту важную область исследований (De-Deus и др. 2008, 2010, 2011).

Несколько исследований с использованием недеструктивной технологии микро-КТ показали, что подготовка стенок корневых каналов с помощью эндодонтических инструментов, активированных в ротационном или возвратно-поступательном движении, не является идеальной (Paqué и др. 2010, Paqué & Peters 2011, Versiani и др. 2013, De-Deus и др. 2015, Zuolo и др. 2018).

Механическая подготовка с использованием этих инструментов ограничена, так как они, как правило, обрабатывают только центральные аспекты корневых каналов для создания круглой формы, оставляя большинство щечных и язычных расширений этих сложных пространств нетронутыми, даже при попытках боковых движений, таких как при использовании движения щетки (Paqué и др. 2010, Paqué & Peters 2011, Versiani и др. 2013, De-Deus и др. 2015, Zuolo и др. 2018).

Хотя микро-КТ может предоставить ценные и точные измерения относительно положения и количества удаленного дентинного материала во время подготовки канала, она не предоставляет информации о пульповой ткани или микробных биопленках, которые могут оставаться прикрепленными к стенкам корневых каналов, особенно в областях, недоступных для механического действия инструментов, таких как истмусы, плавники, анастомозы и дополнительные каналы (Versiani и др. 2013). Это означает, что микро-КТ в основном ограничена оценкой изменений в дентинных стенках, поскольку по своей сути микро-КТ не подходит для визуализации мягких тканей, так как они практически «прозрачны» для рентгеновских лучей. Это ограничение связано с неспособностью этого радиографического метода, основанного на исследованиях костной ткани и предназначенного для изображения более плотных элементов, таких как кальций, обнаруживать нерадиолучистые мягкие ткани (Rüegsegger и др. 1996). Тем не менее, был достигнут значительный прогресс в исследованиях на основе микро-КТ в других биомедицинских областях, включая различные типы настольных сканеров, захват информации с фазовым контрастом, более быстрые и эффективные протоколы получения сканов и алгоритмы реконструкции. В совокупности такие разработки могут быть использованы для визуализации мягких (некальцинированных) тканей, преодолевая их врожденные ограничения. Для этого можно достичь специфического улучшения визуализации мягких тканей с использованием радиопрозрачных контрастных агентов для достижения ослабления рентгеновских лучей, так называемой техники контрастной микро-КТ (CE-CT). Короче говоря, CE-CT подходит для оценки гетерогенных тканей, таких как зубы.

Контрастные вещества состоят из специфических химических агентов с высокой молекулярной массой, способных естественным образом связываться с мягкими тканями для создания «контраста» эффективным способом. Контрастным веществом, использованным в данном исследовании, был неорганический йод Люголя (I₂KI), который впервые был представлен Метшером (2009a), который протестировал несколько протоколов фиксации образцов и потенциал окрашивания нескольких коммерчески доступных соединений для различных типов мягких тканей. На сегодняшний день было продемонстрировано, что йод Люголя имеет высокую аффинность к гликогену (Феннерти 1999) и нацеливается на эпителиальные клетки и мягкие ткани мышей (Дегенхардт и др. 2010, Баверсток и др. 2013). Таким образом, потенциал йода Люголя для получения изображений пульповой ткани с помощью микро-КТ был протестирован в текущем исследовании. В ходе серии испытаний с различными протоколами импрегнации зубы с обычными доступными полостями, погруженные в раствор Люголя на 7 дней, позволили эффективно импрегнировать пульповую ткань (Рисунки 3 и 7). Однако два аспекта, касающиеся использования метода CE-CT для анализа остатков пульпы в течение времени после ирригации корневого канала раствором NaOCl, могут вызывать беспокойство. Первый аспект связан с химической реакцией NaOCl с йодом раствора Люголя. Несмотря на это взаимодействие, раствор Люголя не значительно снижал протеолитическую способность NaOCl в текущих условиях. Второе беспокойство касалось потенциала NaOCl снизить степень контраста, связанного с импрегнированной йодом Люголя пульповой тканью. Тест на радиопрозрачность показал, что раствор Люголя подходит для импрегнации пульповой ткани, так как NaOCl не вмешивался в его радиопрозрачность. В совокупности эти результаты подтвердили, что раствор Люголя можно использовать в качестве контрастного вещества для тестирования пульповой ткани как субстрата для анализа протоколов ирригации на основе NaOCl. Дальнейший анализ был сосредоточен на валидации раствора Люголя для правильной идентификации пульповой ткани. Для этого использовалась парафиновая гистологическая секция, чтобы подтвердить, видна ли пульповая ткань, импрегнированная раствором Люголя, на сканах микро-КТ. Затем был разработан экспериментальный подход для сравнения гистологических срезов с соответствующими изображениями, полученными из стеков микро-КТ, преодолевая типичные проблемы выравнивания в этом типе корреляционного анализа. Результаты подтвердили правильную идентификацию пульповой ткани на изображениях микро-КТ, импрегнированных йодом Люголя, и таким образом доказали качество протокола импрегнации (Рисунки 4 и 5).

Стоит отметить, что, особенно для эндодонтических исследований с использованием оставшейся пульповой ткани в качестве параметра результата, подход CE-CT имеет явное преимущество, не сосредотачиваясь на ультраструктурной детальной оценке мягкой ткани. Вместо этого CE-CT легко позволяет количественно оценивать оставшуюся пульповую ткань в целом в продольных (со временем) экспериментах (Рисунки 6 и 7). С качественной точки зрения, сотни срезов, произведенных на зубе с помощью CE-CT, могут дать лучшее понимание тесной связи между внутренней анатомией корневых каналов и механическими протоколами формовки и ирригации. Это связано с тем, что CE-CT предоставляет 3D модели высокого разрешения, которые содержат достоверную информацию о размерах, структурной количественной оценке и анатомических особенностях гетерогенных тканей, таких как дентин и пульповая ткань. В то же время этот метод позволяет оценивать предоперационное распределение пульповой ткани по всему каналу до экспериментальных процедур даже после 7 дней без какого-либо протокола фиксации. Это важный момент, так как количество и расположение пульповой ткани могут действовать как мешающий фактор, влияя на результат эксперимента. Таким образом, использование метода CE-CT на зубах с жизнеспособными пульпами кажется действительным и воспроизводимым, так как пульповая ткань была распределена по всей системе корневых каналов во всех здоровых зубах. Будущие исследования с использованием этого инновационного метода должны включать сравнение различных растворов для ирригации (инертные против активных растворов) с течением времени и протоколов подготовки по эффективности растворения/удаления пульповой ткани из систем корневых каналов. Дальнейшие улучшения этого метода также позволят применять его в in vivo исследованиях с использованием CBCT, например. В данный момент настоящая методология требует, чтобы контрастное вещество находилось в контакте с пульповой тканью как минимум 7 дней, и в in vivo подходе также потребуются пред- и постоперационные томографические изображения, которые явно должны соответствовать приемлемым этическим принципам исследований. Определенно, настоящий протокол должен быть валидирован in vivo с использованием CBCT. С другой стороны, его можно безопасно применять in vivo на некариозных и не восстановленных зубах с жизнеспособными пульпами, запланированными на удаление, без пред- или постоперационных сканирований. Например, после подтверждения жизнеспособного состояния пульпы с помощью обычных тестов, химико-механический протокол может быть применен in situ, а контрастный раствор введен в пространство пульпового канала, и корональная доступная полость восстановлена, чтобы обеспечить сохранение раствора Люголя в пространстве корневого канала. Затем зуб может быть удален, сохранен и оценен с помощью микрокомпьютерной томографии через неделю.

В заключение, текущее исследование сосредоточено на предоставлении предварительных, но оригинальных доказательств в поддержку неразрушающих продольных исследований CE-CT с использованием оставшейся пульпы в качестве параметра результата. Было продемонстрировано, что CE-CT объединяет в одном методе основные преимущества технологии микрокомпьютерной томографии (оценка минерализованной ткани) и традиционных гистологических методов (оценка неминерализованной ткани) для изучения процедур дентального дебридмента, включая возможность оценки, идентификации и измерения тех участков канала, которые не подвергались механической подготовке или протоколам ирригации. Стоит отметить, что CE-CT позволяет изучать механическую подготовку канала и протоколы ирригации независимо или комбинированный синергетический эффект химико-механических процедур.

Выводы

Раствор Люголя позволил визуализировать пульповую ткань на изображениях микрокомпьютерной томографии. Раствор Люголя не подвергался воздействию NaOCl в своей радиопрозрачности и не мешал растворению фиксированных и окрашенных мягких тканей. В практическом плане представленная техника контрастной микрокомпьютерной томографии с раствором Люголя позволяет оценивать эффект химического растворения и механического удаления пульповой ткани с помощью процедур очистки и формовки независимо или вместе, что делает ее очень полезной техникой в лабораторных исследованиях эндодонтии.

Авторы: G. De-Deus, F. G. Belladonna, D. M. Cavalcante, M. Simões-Carvalho, E. J. N. L. Silva, J. C. A. Carvalhal, R. Q. Zamolyi, R. T. Lopes, M. A. Versiani, P. M. H. Dummer и M. Zehnder

Ссылки:

1. Alfaro DP, Ruse ND, Carvalho RM, Wyatt CC (2015) Оценка внутренней подгонки коронок из литиевого дисиликатa с использованием микро-КТ. Журнал Протезирования 24, 381–6.
2. Baverstock H, Jeffery NS, Cobb SN (2013) Морфология жевательной мускулатуры мыши. Журнал Анатомии 223, 46–60.
3. Cunha AC, Marquezan M, Lima I, Lopes RT, Nojima LI, Sant’Anna EF (2015) Влияние архитектуры кости на первичную стабильность различных дизайнов мини-имплантов. Американский журнал ортодонтии и челюстно-лицевой ортопедии 147, 45–51.
4. De-Deus G, Reis C, Beznos D, Gruetzmacher-de-Abranches AM, Coutinho-Filho T, Pacionrik S (2008) Ограниченная способность трех широко используемых термопластических техник заполнения овальных каналов. Журнал Эндодонтии 34, 1401–5.
5. De-Deus G, Barino B, Quintella Zamolyi R и др. (2010) Подоптимальное качество дебридмента, полученное с помощью техники одиночного файла F2 ProTaper в овальных каналах. Журнал Эндодонтии 36, 1897–900.
6. De-Deus G, Souza EM, Barino B и др. (2011) Саморегулируемый файл оптимизирует качество дебридмента в овальных корневых каналах. Журнал Эндодонтии 37, 701–5.
7. De-Deus G, Belladonna FG, Silva EJ и др. (2015) Оценка микро-КТ неинструментированных областей каналов с различными расширениями, выполненными системами NiTi. Бразильский стоматологический журнал 26, 624–9.
8. De-Deus G, Simões-Carvalho M, Belladonna FG и др. (2020) Создание хорошо сбалансированных экспериментальных групп для сравнительных лабораторных исследований в эндодонтии: новое предложение на основе микро-КТ и in silico методов. Международный журнал эндодонтии 53, 974–85.
9. Degenhardt K, Wright AC, Horng D, Padmanabhan A, Epstein JA (2010) Быстрая 3D фенотипизация сердечно-сосудистого развития у эмбрионов мышей с помощью микро-КТ с йодным окрашиванием. Циркуляция: Сердечно-сосудистая визуализация 3, 314–22.
10. Faulwetter S, Vasileiadou A, Kouratoras M, Dailianis T, Arvanitidis C (2013) Микро-компьютерная томография: введение новых измерений в таксономию. ZooKeys 263, 1–45. Fedorov A, Beichel R, Kalpathy-Cramer J и др. (2012) 3D
11. Slicer как платформа для вычислительной обработки изображений для количественной визуализации. Магнитно-резонансная томография 30, 1323–41.
12. Fennerty MB (1999) Окрашивание тканей. Клиники гастроинтестинальной эндоскопии Северной Америки 4, 297–311.
13. Gignac PM, Kley NJ (2014) Увеличенная йодом микро-КТ визуализация: методологические усовершенствования для изучения анатомии мягких тканей постэмбриональных позвоночных. Журнал экспериментальной зоологии Часть B: Молекулярная и развивающаяся эволюция 322, 166–76.
14. Gysi A, Röse C (1894) Сборник микрофотографий для иллюстрации микроскопической структуры зубов человека. Микрофотографии зубной гистологии. Цюрих: Швейцария.
15. Hatton EH, Skillen WG, Moen OH (1928) Гистологические находки в зубах с обработанными и заполненными корневыми каналами. Журнал Американской стоматологической ассоциации 15, 56.
16. Henson MM, Henson OW Jr, Gewalt SL, Wilson JL, Johnson GA (1994) Визуализация улитки с помощью магнитно-резонансной микроскопии. Исследование слуха 75, 75–80.
17. Heimel P, Swiadek NV, Slezak P и др. (2019) Увеличенная йодом микро-КТ визуализация мягких тканей на примере регенерации периферического нерва. Контрастные медиагенераторы и молекулярная визуализация 2019, 1–15.
18. Hertig G, Zehnder M, Woloszyk A, Mitsiadis T, Ivica A, Weber F (2017) Иодиксан в качестве контрастного агента в фибриновом гидрогеле для эндодонтических приложений. Фронтальные исследования в физиологии 8, 152.
19. Kölliker VA (1852) Руководство по тканевой анатомии человека, 1-е изд. Лейпциг: W. Engelmann, с. 405.
20. Lacerda MFLS, Marceliano-Alves MF, P´erez AR и др. (2017) Очистка и формирование овальных каналов с использованием 3 систем инструментов: корреляционное микро-компьютерное томографическое и гистологическое исследование. Журнал Эндодонтии 43, 1878–84.
21. Lane & Ráliš (1983) Изменения в размерах крупных образцов губчатой кости во время гистологической подготовки, измеренные на срезах из головок бедренной кости человека. Международный журнал кальцинированных тканей 35, 1–4.
22. Metscher BD (2009a) Микро-КТ для сравнительной морфологии: простые методы окрашивания позволяют получать высококонтрастные 3D изображения разнообразных неминерализованных тканей животных. BMC Физиология 9, 11.
23. Metscher BD (2009b) Микро-КТ для развивающей биологии: универсальный инструмент для высококонтрастной 3D визуализации на гистологическом уровне. Развивающая динамика 238, 632–40.
24. Paqué F, Balmer M, Attin T, Peters OA (2010) Подготовка овальных корневых каналов в нижних молярах с использованием ротационных инструментов из никель-титана: исследование с использованием микро-компьютерной томографии. Журнал Эндодонтии 36, 703–7.
25. Paqué F, Peters OA (2011) Оценка микро-компьютерной томографии подготовки длинных овальных корневых каналов в нижних молярах с помощью саморегулируемого файла. Журнал Эндодонтии 37, 517–21.
26. Pauwels E, Van Loo D, Cornillie P, Brabant L, Van Hoorebeke L (2013) Исследование контрастных агентов для визуализации мягких тканей с помощью высокоразрешающей рентгеновской компьютерной томографии. Журнал Микроскопии 250, 21–31.
27. Ricucci D, Siqueira JF Jr, Bate AL, Pitt Ford TR (2009) Гистологическое исследование зубов, обработанных корневым каналом, с апикальным периодонтитом: ретроспективное исследование двадцати четырех пациентов. Журнал Эндодонтии 35, 493–502.
28. Ricucci D, Siqueira JF Jr (2011) Судьба ткани в боковых каналах и апикальных разветвлениях в ответ на патологические условия и процедуры лечения. Журнал Эндодонтии 36, 1–15.
29. Rown MAB, Eed RBR, Enry RWH (2002) Влияние средств обезвоживания и температуры на общее время обезвоживания и усадку тканей. Журнал Международного общества по пластинации 17, 28–33.
30. Rüegsegger P, Koller B, Müller R (1996) Микротомографическая система для неразрушающей оценки архитектуры кости. Международный журнал кальцинированных тканей 58, 24–9.
31. Siqueira JF Jr, Pérez AR, Marceliano-Alves MF и др. (2018) Что происходит с неподготовленными стенками корневых каналов: корреляционный анализ с использованием микро-компьютерной томографии и гистологии/сканирующей электронной микроскопии. Международный журнал эндодонтии 51, 501–8.
32. Versiani MA, Leoni GB, Steier L и др. (2013) Исследование микро-компьютерной томографии овальных каналов, подготовленных с помощью саморегулируемого файла, Reciproc, WaveOne и Pro-Taper универсальных систем. Журнал Эндодонтии 39, 1060–6.
33. Vogel AI (1978) Учебник по количественному неорганическому анализу, включая элементарный инструментальный анализ. 4-е изд. Лондон: Longmans, Green and Co., Ltd. с. 925.
34. Walton RE (1976) Гистологическая оценка различных методов увеличения пространства пульпового канала. Журнал Эндодонтии 2, 304–11.
35. Zehnder M (2006) Ирригаторы для корневых каналов. Журнал Эндодонтии 32, 389–98.
36. Zuolo ML, Zaia AA, Belladonna FG и др. (2018) Оценка микро-КТ способности формировать четыре системы инструментов корневых каналов в овальных каналах. Международный журнал эндодонтии 51, 564–71.